酶標儀的選擇

上海連橋生物科技有限公司

一、濾片Vs光柵

　　多功能酶標儀的分類(lèi)方法眾多，但zui簡(jiǎn)單的莫過(guò)于用他們的濾光方式來(lái)作分界線(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)，可以分為濾光片型和光柵型兩大類(lèi)。當然也有一些型號，例如Synergy4和EnVision等，一臺機器里面同時(shí)裝上了濾光片和光柵。但是濾片和光柵并不能同時(shí)完成同一個(gè)檢測，還是想用光柵的時(shí)候用光柵，該用濾片的時(shí)候用濾片;還有一些實(shí)驗非用其中一個(gè)不可，另一模塊實(shí)現不了的。所以這類(lèi)儀器本質(zhì)上還只是把濾片和光柵放在了一起，并沒(méi)有使兩者糅合而產(chǎn)生新的技術(shù)突破。

　　總體來(lái)說(shuō)，濾片技術(shù)由于發(fā)展已久，配合二向色鏡(其實(shí)也就是另一模式的濾光反光濾鏡)等光路系統，可以實(shí)現大部分實(shí)驗的需要。目前常規多功能酶標儀中高的檢測靈敏度就是用濾光片型做出來(lái)的，例如TECAN Infinite F500的熒光檢測的靈敏度可以達到0.04 fmol/孔(熒光素，384孔/80ul)。

　　但是濾光片型儀器由于受限于濾片的波長(cháng)和數量限制，不可能滿(mǎn)足日益增加的實(shí)驗類(lèi)型的檢測需要，而且有時(shí)需要對物質(zhì)的吸收、激發(fā)和發(fā)射光譜進(jìn)行研究，所以后來(lái)就誕生了光柵型的儀器。

　　最先推出光柵的是MD公司，其光柵習慣上稱(chēng)為單光柵。由于光純度的不足，在光柵的后面又加入了一組帶阻濾片，再把雜光過(guò)濾一遍，達到了5×10^-4的雜光率，基本與純粹的濾光片系統一致。后來(lái)TECAN又發(fā)展出了雙光柵技術(shù)，通過(guò)兩次光柵濾光，雜光率降到了10^-6。后來(lái)，Thermo、BioTek和PE的部分新款儀器等都使用了類(lèi)似雙光柵技術(shù)。由于激發(fā)和發(fā)射各用了一組雙光柵，此類(lèi)機器又被稱(chēng)為四光柵型多功能酶標儀。

　　光柵型酶標儀的推陳出新，使得用戶(hù)在波長(cháng)選擇上不再受限，而且在雜光率、帶寬控制等性能上還超越了濾光片系統。例如，TECAN公司在2008年底推出使用了第三代四光柵系統的M1000酶標儀，雜光率降到了2×10^-7的新低，還實(shí)現了帶寬2.5～20nm連續可調。這些都是目前濾光片型酶標儀所不能或者較難實(shí)現的。

　　二、雜光率&波長(cháng)準確性

　　光柵型濾光系統儼然已經(jīng)成為了目前通用性多功能酶標儀的主流，多家廠(chǎng)家共同努力，已經(jīng)把光柵技術(shù)推到了歷史新高。在光柵的眾多技術(shù)參數之中，最關(guān)鍵的無(wú)疑就是光柵的雜光率和波長(cháng)選擇的準確性了。

　　雜光率指得就是光源通過(guò)光柵后，得到的光線(xiàn)中，“不需要”的波長(cháng)的光占所標稱(chēng)波長(cháng)的光的比例，表征了濾光的純度。由于光線(xiàn)干涉、衍射等的復雜性，無(wú)論使用濾光片還是光柵，雜光都是不可避免的。各種濾光技術(shù)的本質(zhì)就是要想辦法把雜光盡可能地去掉。一般來(lái)說(shuō)，濾光片型的雜光率在10^-4～10^-5之間，光柵型的可以做到10^-6～10^-7。由于此類(lèi)雜光是非特異的，而且會(huì )直接進(jìn)入最后的檢測器，所以有多少的雜光就會(huì )引入多少的隨機誤差。在熒光等檢測過(guò)程中，由于檢測器存在放大效應，雜光率的干擾也會(huì )被指數級放大。因此，雜光率就是一個(gè)濾光系統的首要性能指標。

　　光柵的另一個(gè)重要指標就是波長(cháng)選擇的準確性。因為很多檢測是依賴(lài)于物質(zhì)在某個(gè)波長(cháng)的特征圖譜。就像DNA/RNA的OD260濃度測定，實(shí)際檢測波長(cháng)偏離260nm幾個(gè)nm以上的話(huà)，OD值與最終濃度之間的數學(xué)關(guān)系就會(huì )發(fā)生改變。因此，一組性能優(yōu)良的光柵系統，他的波長(cháng)選擇準確性應該是在±0.5～1nm之間。波長(cháng)偏離過(guò)大有時(shí)就會(huì )影響到最終結果的準確性。

　　這兩個(gè)可謂是光柵甚至濾光片濾光系統最關(guān)鍵的技術(shù)參數，直接影響到的是得到數據是否是真正所要測量的結果，是實(shí)驗結果可靠性的最基本要求。

　　三、認證>參數

　　在保證檢測可靠的基礎上，不同儀器的下一個(gè)差異就體現在檢測的靈敏度上面，這時(shí)人們關(guān)心的就是儀器能夠檢測到多弱的信號。

　　靈敏度涉及了整個(gè)光路系統的設計和選料，很難說(shuō)某一個(gè)部件會(huì )起決定性作用。但是有一點(diǎn)，在各種單功能檢測項目中，光吸收檢測用非放大型的光電二極管、熒光檢測用光電倍增管、發(fā)光檢測用專(zhuān)門(mén)設計的單光子計數光電倍增管，這三種不同的檢測器是各自檢測領(lǐng)域的優(yōu)先選擇。

　　各單項檢測的*結果都是用相應檢測器完成的。當然也有的儀器出于成本等考慮，用一個(gè)檢測器兼容多種檢測模式，這在一定程度上也能完成實(shí)驗需求，但是在性能上也會(huì )有所犧牲折中，無(wú)法實(shí)現各項檢測都達到*化。

　　關(guān)于靈敏度的定義和檢測標準，每個(gè)廠(chǎng)家都有各自的描述，都會(huì )說(shuō)自己是怎樣怎樣好，很難有一個(gè)直觀(guān)的客觀(guān)比較。因此，某些試劑廠(chǎng)家就站了出來(lái)，對某些儀器的檢測性能提供一個(gè)第三方的認證。

　　比較常見(jiàn)的是發(fā)光檢測領(lǐng)域里面的Promega公司DLReady認證，熒光檢測領(lǐng)域的Invitrogen公司的LanthaScreen系列認證、Cisbio公司的HTRF認證、BellBrook實(shí)驗室的Transcreener認證等等。這些認證主要是針對公司提供的某一類(lèi)型的要求較高的試劑盒，涵蓋了對檢測儀器的各種性能要求，包括：檢測方法是否能用，靈敏度、線(xiàn)性范圍、孔間干擾等是否滿(mǎn)足要求等等。

　　如果需要做相關(guān)的實(shí)驗，例如做Luciferase發(fā)光檢測的就看看儀器是否有DLReady認證、做TR-FRET的就看看HTRF認證、做FP就看看Transcreener認證，如果機器擁有相關(guān)的認證，就可以說(shuō)明該機器在一定程度上能夠較好地滿(mǎn)足類(lèi)似檢測的各種需求，遠比單單比較一個(gè)靈敏度參數更能說(shuō)明問(wèn)題。因為一個(gè)實(shí)驗能否做好并不是單單一個(gè)靈敏度就能表征的。

　　需要特別注意的是，LanthaScreen是一個(gè)系列的認證，涵蓋了FI、FRET、TRF、FP等多個(gè)子項目，不同儀器所通過(guò)的子項目是不一樣的，需要上Invitrogen網(wǎng)站仔細查詢(xún)核對。

　　光柵型的儀器由于新技術(shù)近幾年才逐漸興起，受限于技術(shù)研發(fā)和儀器成本，同一個(gè)價(jià)格范圍內的靈敏度等指標會(huì )略差于發(fā)展成熟的濾光片機器。所以，在中檔多功能酶標儀領(lǐng)域，拿到了各種認證的光柵型儀器并不多見(jiàn)。而作為新一代光柵型酶標儀的代表作，TECAN M1000已經(jīng)拿到了全部上述四種認證，而且在靈敏度等單項性能上也已經(jīng)超越了不少的中g(shù)ao端濾片型酶標儀。

　　這說(shuō)明了光柵型酶標儀的研發(fā)又進(jìn)入了一個(gè)新的高度，除了在靈活性上取得了無(wú)可ti代的作用外，還在檢測靈敏度等方面也逐漸替代傳統的濾光片型酶標儀。光柵型是科研領(lǐng)域多功能酶標儀的未來(lái)主要發(fā)展趨勢;而濾光片型儀器也正在往單項性能更優(yōu)的方面改進(jìn)。

　　四、比色杯+微量檢測

除了常規的6～384/1536孔酶標板檢測之外，有些儀器還附帶了比色杯、微量檢測板等的兼容功能。無(wú)論是使用立式比色杯、臥式比色杯還是各種微量檢測板，其目的都是給光程不固定的酶標板檢測引入一個(gè)標準光程的概念。雖然酶標板檢測也能通過(guò)光程校正等方式實(shí)現10mm光程O(píng)D值的換算，但這只是一個(gè)數學(xué)轉換過(guò)程，檢測誤差累積較多，實(shí)際使用效果不佳。引入比色杯和微量檢測板后，光吸收的檢測光程就被固定在10mm或者0.5mm等的標準長(cháng)度，OD值換算更加簡(jiǎn)單和準確。附帶了此類(lèi)檢測功能的酶標儀，相當于除了本身的多功能酶標檢測之外，還能替代部分分光光度計的功能，使其功能更加全面，儀器的性?xún)r(jià)比更高。

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