液相色譜（HPLC）法選擇性高、靈敏度高、分析速度快，而且大部分可以溶解的藥物能用該法分析，所以該技術(shù)已經(jīng)成為藥物分析的首。色譜柱是液相分離系統的中重要的環(huán)節，業(yè)內常把色譜柱比喻為液相色譜的心臟，因為色譜柱的類(lèi)型決定了色譜系統的性質(zhì)，色譜柱的粒徑和長(cháng)度影響了分析時(shí)間和分析效率。氨基柱、苯基柱、氰基柱等正相色譜柱和C18、C8等反相色譜柱是藥物分析與評價(jià)工作中常見(jiàn)的兩類(lèi)色譜柱。

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以碳十八硅烷化學(xué)鍵合硅膠固定相（C18 或ODS）的反相色譜出色地完成了液相色譜分析任務(wù)，而且與其他色譜相比，C18反相色譜有明顯的優(yōu)勢，它可直接進(jìn)樣分析水溶性樣品，因而適用范圍廣，被譽(yù)為“標準固定相分離模式。各國藥典涉及使用液相色譜法進(jìn)行檢測的品種當中，C18色譜柱作為固定相應用為廣泛。目前市場(chǎng)上有600多種C18色譜柱，且不斷有新的色譜柱出現。采用不同的C18色譜柱分析具體樣品時(shí)，保留時(shí)間、溶質(zhì)之間的分離情況、出峰順序等色譜柱的保留行為都可能出現較大的差異?！睹绹幍洹罚?/span>USP）、《歐洲藥典》和《日本藥局方》對色譜柱的規定比較詳細，除注明填料所屬的大類(lèi)別外，通常還給出色譜柱的內徑、長(cháng)度、粒徑、比表面積等信息，有些品種還會(huì )直接注明色譜柱的廠(chǎng)家。在美國藥典委員會(huì )可查詢(xún)到USP 推薦的色譜柱品牌與型號。而《中國藥典》僅指明色譜柱的填料大類(lèi)，如十八烷基硅烷鍵合硅膠。由于《中國藥典》缺少選擇色譜柱方面的詳細指導，使得藥典推薦方法的執行遇到困難。在參考文獻執行某一HPLC方法時(shí)，當無(wú)法獲得文獻中所用色譜柱時(shí)，需要尋求選擇性相似的色譜柱代替。

1 C18 色譜柱的差異

十八烷基硅烷（常被稱(chēng)為ODS 或C18）是早的鍵合固定相之一，C18是具有烷基鏈的硅烷化劑與硅膠表面的硅醇基反應制得的鍵合相。因為使用了共價(jià)鍵和的方式將烷基鏈緊緊固定在硅膠表面，所以烷基鏈不會(huì )被流動(dòng)相沖洗掉，作為色譜固定相穩定發(fā)揮作用。C18色譜柱因鍵合方式的不同、粒徑的不同、長(cháng)度的不同，內徑的差異等多方面因素，呈現出不同選擇性。這樣，在市場(chǎng)上就出現了數百種具有不同分離選擇特性的C18色譜柱。

《中國藥典》增加了麥白霉素A 有關(guān)物質(zhì)及其組分的檢查，但并未C18 色譜柱的型號和品牌。吳群等[7]考察了8 種C18 色譜柱對麥白霉素片A組分和有關(guān)物質(zhì)的分析效果。其中只有5種C18色譜柱能對麥白霉素A中各組分能達到較好分離。不同C18色譜柱之間的分離度差別較大，影響藥物有關(guān)物質(zhì)和組分的測定。

相同規格的C18 色譜柱由于生產(chǎn)廠(chǎng)家的不同也會(huì )產(chǎn)生較大的分析差異。用5 種相同規格、不同生產(chǎn)廠(chǎng)家的C18色譜柱測定胸腺法新有關(guān)物質(zhì)，結果5種C18色譜柱表現的分離度和保留時(shí)間差異很大。有的色譜柱表現的分離效果甚至不符合藥典的要求。用3種同規格不同品牌的C18色譜柱考察了不同廠(chǎng)家色譜柱對注射用琥珀酸鈉與相關(guān)物質(zhì)分離的效果。其中兩種C18色譜柱出峰順序不符合《中國藥典》規定?？梢?jiàn)琥珀酸鈉對于色譜柱固定相的選擇性很強。C18色譜柱內部填料的粒度、孔徑、鍵合量及填充的工藝、技術(shù)等差異是上述現象的主要原因。

2 C18 色譜柱的選擇

分析化學(xué)中可以根據pH環(huán)境、流動(dòng)相極性、色譜柱的分類(lèi)系統、藥物極性等來(lái)選擇合適的C18色譜柱。因為在藥物分析中，藥物的極性一般是無(wú)法改變的，所以下文主要介紹根據pH環(huán)境、流動(dòng)相極性、色譜柱的分類(lèi)系統來(lái)選擇C18色譜柱。

2.1 pH 環(huán)境

對于傳統的C18色譜柱，pH值使用范圍通常為2～7，因為pH值高于8時(shí)C18固定相會(huì )受到限制。由于殘余硅羥基的存在，易對堿性化合物造成不可逆吸附，造成峰拖尾，影響分離與分析。pH值太低則會(huì )使鍵合的烷基脫落，而且對成分的分離達不到要求。

2.1.1 酸性條件下C18的選擇  為了改善C18色譜柱在低pH值時(shí)的穩定性，有人提出了空間位阻方法?？臻g位阻作用是指連接較大基團，立體阻礙溶質(zhì)基團進(jìn)攻硅醇基，使硅氧烷能夠再生，提高了化學(xué)鍵合固定相抗水解的能力。還有人制備了側鏈中含有異丙基或異丁基的C18化學(xué)鍵合固定相。該固定相由于引入了較大的側鏈基團，立體阻礙了殘留硅醇基與溶質(zhì)之間的相互作用，在低pH值條件下能夠保持穩定，這種化學(xué)鍵合固定相更適合酸性物質(zhì)的分離。Zorbax Stable Bond C18色譜柱就使用了空間位阻技術(shù)，其使用單官能團硅烷，具有較大的二異丁基（SB-C18）側鏈基團，空間位阻關(guān)鍵的硅氧烷鍵合到硅膠表面，以避免在低pH值條件下水解破壞，在酸性流動(dòng)相條件下提供良好的穩定性和重現性。因此，Stable Bond色譜柱成為低pH值方法開(kāi)發(fā)的首。在方法開(kāi)發(fā)初期，若選定流動(dòng)相為酸性，可將此類(lèi)色譜柱作為首。

2.1.2 堿性條件下C18的選擇制造快速分離堿性化合物的化學(xué)鍵合相一直是研究熱點(diǎn)。雙齒鍵合固定相的每個(gè)硅烷化分子中含有兩個(gè)硅原子，兩個(gè)硅原子之間以-O-或-CH2-CH2 等基團連接，每個(gè)硅原子含有1個(gè)C18官能團。它的環(huán)狀結構無(wú)論在低pH值條件下，還是高pH值條件下均顯示了較高的穩定性和滿(mǎn)意的柱效。與傳統的單齒化學(xué)鍵合相相比，這種化學(xué)鍵合固定相突出的優(yōu)點(diǎn)是在低、中、高pH 值時(shí)都有很好的穩定性。使用C18雙齒化學(xué)鍵合固定相的商品柱有Zorbax Extend-C18 色譜柱，其耐受pH 值達11.5，特別適合在高pH 值的流動(dòng)相條件下對強堿性化合物進(jìn)行有效的色譜分離。在開(kāi)發(fā)普魯卡因有關(guān)物質(zhì)的藥物分析方法中，對比8種C18色譜柱，終選擇了耐受pH值范圍較大的Zorbax Extend C18色譜柱。分析樣品與雜質(zhì)均為堿性，使用Zorbax Extend C18使各雜質(zhì)與組分間分離。若堿性物質(zhì)間的分離效果不佳，可以考慮使用上述鍵合相填料的C18 色譜柱。

2.2 流動(dòng)相極性

極性基團嵌入化學(xué)鍵合相技術(shù)是分離極性較大物質(zhì)的一個(gè)方法，這種鍵合相可以在強極性流動(dòng)相條件下長(cháng)期使用。Symmetry Shield TM RP C18色譜柱是嵌入了氨基甲酸酯基團的反相色譜柱，用該固定相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）對鹽酸小檗堿進(jìn)行HPLC分析。實(shí)驗中流動(dòng)相為強極性水，鹽酸小檗堿為堿性化合物。通過(guò)對比其他色譜柱，上述色譜柱的理論塔板數高，沒(méi)有拖尾現象。嵌入了氨基甲酸酯基團的鍵合相不但阻止了殘留硅醇基與堿性化合物之間的作用，而且提高了水潤濕性，特別適合在使用極性流動(dòng)相情況下分離堿性物質(zhì)。

采用Zorbax Bonus -RP C18色譜柱同時(shí)測定暗紫貝母藥材中5個(gè)核苷類(lèi)活性成分及5個(gè)游離的堿基。實(shí)驗中流動(dòng)相極性較大，所分離組分酸堿程度相差較大。使用其他的C18色譜柱造成了峰型對稱(chēng)性差、使用壽命短、拖尾等現象。ZorbaxBonus-RP C18色譜柱有極性酰胺基團，側鏈還有二異丙基，可以提供空間保護作用，避免酸水解。其極性流動(dòng)相條件下既可以分離堿性化合物，也可以分離酸性化合物。

中草藥成分較為復雜，含有較多極性非極性等組分。研究血暢寧組方中總皂苷的HPLC法分析，采用Fusion-RP C18 色譜柱，在強極性流動(dòng)相條件下，各類(lèi)極性不同的皂苷組分間達到分離。Fusion-RP C18色譜柱由于鍵入了極性基團，而且擁有疏水鏈，其可以在100%的水相流動(dòng)相條件下長(cháng)時(shí)間運轉，特別適合于在強極性條件下分析含有極性和非極性化合物的混合物。

2.3 色譜柱分類(lèi)系統

重復某一方法，但由于某種原因無(wú)法獲得目標色譜柱時(shí)，需要選擇與目標色譜柱有相似保留行為的色譜柱來(lái)開(kāi)展實(shí)驗。通過(guò)對色譜柱的保留行為進(jìn)行表征，可以快速選擇出相似色譜柱。表征反相色譜柱的方法從20世紀70年代開(kāi)始就一直被廣泛研究。使用5個(gè)參數表征色譜柱，使用4個(gè)參數，使用6個(gè)參數，USP使用5個(gè)參數，分別對色譜柱的保留行為進(jìn)行了量化的參數表征。表征兩個(gè)色譜柱的參數越接近，代表它們的選擇性越相似，表明可以替換使用。魯漢大學(xué)所建的色譜柱分類(lèi)系統用4種參數表征色譜柱?？梢酝ㄟ^(guò)該色譜柱選擇系統對比100多種色譜柱（多為C18色譜柱）的相似程度，這就為C18色譜柱的選擇提供了極大便利。

中國藥典品種項下規定乙酞螺旋霉素用十八烷基硅烷作為固定相，未給出品牌和規格等詳盡信息。通過(guò)運用魯漢大學(xué)所建的色譜柱分類(lèi)系統，選擇出了合適的色譜柱，并通過(guò)實(shí)際實(shí)驗驗證了了魯漢大學(xué)所建的色譜柱分類(lèi)系統的科學(xué)性和實(shí)用性。通過(guò)分析阿夫唑嗪有關(guān)物質(zhì)來(lái)評價(jià)魯漢大學(xué)所建的色譜柱分類(lèi)系統。實(shí)驗對比了36種色譜柱的分離情況，后將36種色譜柱通過(guò)色譜柱分類(lèi)系統進(jìn)行判斷。結果顯示該色譜柱分類(lèi)系統可以表征色譜柱的保留行為，進(jìn)而可以進(jìn)行色譜柱的選擇和對比。

3 結語(yǔ)

不同C18 色譜柱之間的保留行為差別很大，選擇合適的C18是藥物分析工作的重點(diǎn)。需要一種科學(xué)的方法對色譜柱進(jìn)行表征和分類(lèi)，然后才可以進(jìn)行快速的選擇。目前，各類(lèi)新型的C18鍵合相層出不窮，從鍵合相類(lèi)型方面對其分類(lèi)較為困難。而且，色譜柱的選擇行為與鍵合相的類(lèi)型關(guān)系不大。所以本文只是論述了在酸堿情況下如何選擇分離效果較好的C18鍵合相及強極性條件下如何選擇耐用的C18鍵合相，并未就此進(jìn)行色譜柱的分類(lèi)歸納。

   近年來(lái)，表征色譜柱的方法成為研究的熱點(diǎn)，通過(guò)一組參數對每個(gè)色譜柱進(jìn)行量化，建立各類(lèi)色譜柱分類(lèi)系統，極大便利了色譜柱的比較和選擇。在選擇色譜柱時(shí)，可以應用以上提到的魯漢大學(xué)所建的色譜柱分類(lèi)系統或者登陸USP 查詢(xún)到各類(lèi)色譜柱參數，以及找到相似色譜柱。

目前使用《中國藥典》未能對各品種項下的色譜柱進(jìn)行品牌和規格方面的規定。在藥物分析工作中，我們要注意到色譜柱之間的差異，并挑選合適的色譜柱來(lái)開(kāi)展實(shí)驗。希望新版《中國藥典》對色譜柱能進(jìn)行更為詳盡的規定，以方便藥物分析與評價(jià)工作者。